Differenza tra Sanger Sequencing e Pyrosequencing | Sanger Sequencing vs Pyrosequencing

Chiave Difference - sequenziamento Sanger vs Pyrosequencing

sequenziamento del DNA è molto importante per l'analisi del DNA poiché la conoscenza della corretta disposizione dei nucleotidi su una particolare regione del DNA rivela molte importanti informazioni su di esso. Ci sono diversi metodi di sequenziamento del DNA. Il sequenziamento di Sanger e Pyrosequencing sono due diversi metodi di sequenziamento del DNA ampiamente usati nella Biologia Molecolare. La differenza fondamentale tra Sanger sequenziamento e Pyrosequencing è che sequenziamento Sanger utilizza dideoxynucleotides di interrompere la sintesi del DNA per leggere la sequenza nucleotidica mentre pirosequenziamento rileva il rilascio pirofosfato incorporando i nucleotidi e sintetizzare la sequenza complementare di leggere l'ordine preciso del sequenza.

SOMMARIO

1. Panoramica e differenza chiave

2. Che cosa è Sanger Sequencing

3. Che cosa è Pyrosequencing

4. Confronto laterale - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing

5. Riepilogo

Che cosa è Sanger Sequencing?

Il sequenziamento di Sanger è un metodo di sequenza di DNA di prima generazione sviluppato da Frederick Sanger e dai suoi collegi nel 1977. È noto anche come Sequencing di terminazione di catena o sequenza di diaidio in quanto si basa su terminazione catena da dideossinucleotidi (ddNTPs). Questo metodo è stato ampiamente utilizzato per più di 30 anni fino a quando è stato sviluppato il New Sequencing Generation (NGS). La tecnica di sequenziamento di Sanger ha permesso di scoprire l'ordine corretto del nucleotide o l'attaccamento di un particolare frammento di DNA. È basato sulla incorporazione selettiva di ddNTPs e la terminazione della sintesi del DNA durante la in vitro replicazione del DNA. L'assenza di 3 'OH gruppi per continuare la formazione di legame di fosfodiestri tra nucleotidi adiacenti è una caratteristica unica di ddNTPs. Quindi, una volta che il ddNTP è collegato, l'allungamento della catena cessa e termina da quel punto. Esistono quattro ddNTPs - ddATP, ddCTP, ddGTP e ddTTP - utilizzati nel sequenziamento di Sanger. Questi nucleotidi fermano il processo di replicazione del DNA quando sono incorporati nel filamento crescente del DNA e provocano varie lunghezze di brevi DNA. L'elettroforesi del gel capillare è usato per organizzare questi fili di DNA corti per le loro dimensioni su un gel come mostrato nella Figura 01.

Figura 1: Elettroforesi del gel capillare del DNA corto sintetizzato

Per

in vitro replicazione del DNA, bisogna prevedere pochi requisiti. Sono l'enzima della DNA polimerasi, il template DNA, i primer degli oligonucleotidi e i deossinucleotidi (dNTPs). Nel sequenziamento di Sanger, la replica del DNA viene eseguita in quattro distinte teste insieme a quattro tipi di ddNTP separatamente. Deossinucleotidi non sono totalmente sostituiti dai rispettivi ddNTP. Una miscela del particolare dNTP (ad esempio, dATP + ddATP) è inclusa nel tubo e viene replicata. Quattro prodotti tubi separati vengono eseguiti su un gel in quattro pozzetti separati. Quindi leggendo il gel, la sequenza può essere costruita come mostrato nella Figura 02. La sequenza di Sanger è una tecnica importante che aiuta in molte aree della biologia molecolare. Il progetto del genoma umano è stato completato con l'aiuto di metodi di sequenziamento Sanger. Il sequenziamento di Sanger è utile anche nel sequenziamento del DNA bersaglio, ricerca di cancro e malattia genetica, analisi delle espressioni geniche, identificazione umana, rilevamento degli agenti patogeni, sequenziamento microbico ecc.

Ci sono diversi svantaggi di sequenziamento di Sanger:

La lunghezza del DNA sequenziata non può essere superiore a 1000 paia di base

Solo un filamento può essere sequenziato alla volta.

Il processo richiede tempo e costi.

Pertanto sono state sviluppate nuove tecniche di sequenziamento avanzate per superare questi problemi. Tuttavia, il sequenziamento di Sanger è ancora in uso a causa dei suoi risultati molto accurati fino a circa 850 pezzi di lunghezza di lunghezza.
Che cosa è Pyrosequencing?
Pyrosequencing è una nuova tecnica di sequenziamento del DNA basata sul "sequenziamento per sintesi". Questa tecnica si basa sull'individuazione del rilascio di pirofosfato sulla fusione nucleotidica. Il processo è impiegato da quattro differenti enzimi: DNA polimero, ATP sulfurilasi, luciferasi e apyrasi e due substrati adenosina 5 'fosfosolfato (APS) e luciferina.

Il processo inizia con il legame di primer con il template a DNA monostadullato e la polimerasi del DNA inizia l'incorporazione di nucleotidi complementari ad esso. Quando i nucleotidi si uniscono (polimerizzazione dell'acido nucleico), rilascia i gruppi pirofosfati (due gruppi di fosfati legati insieme) e l'energia. Ogni aggiunta di nucleotidi libera quantità equimolare di pirofosfato. Il pirofosfato si converte in ATP con ATP sulfurilasi in presenza di substrato APS. L'ATP generato porta la conversione luciferasi-mediata di luciferina all'ossiluciferina, producendo luce visibile in quantità che sono proporzionali alla quantità di ATPs. La luce viene rilevata da un dispositivo di rilevazione fotonica o da fotomultipliatore e crea un programma. Apyrase degrada ATP e dNTP non incorporati nella miscela di reazione. L'aggiunta di dNTP viene eseguita una volta alla volta. Poiché l'aggiunta di nucleotide è nota in base all'incorporazione e alla rilevazione della luce, può essere determinata la sequenza del template.Il programma è utilizzato per la generazione della sequenza nucleotidica del DNA campione come mostrato nella Figura 03.

Il pirosequencing è molto importante nell'analisi del polimorfismo singolo nucleotide e sequenziamento di tratti brevi di DNA. L'alta precisione, la flessibilità, la facilità di automazione e l'elaborazione parallela sono i vantaggi del pirosequencing sulle tecniche di sequenziamento di Sanger.

Figura 03: Pyrosequencing

Qual è la differenza tra Sanger Sequencing e Pyrosequencing?

Il sequenziamento di Sanger è un metodo di sequenziamento del DNA basato sulla incorporazione selettiva di ddNTPs mediante DNA polymerasi e terminazione di catena.

Pyrosequencing è un metodo di sequenziamento del DNA basato sulla rilevazione di rilascio di pirofosfato sulla incorporazione del nucleotide.

Uso di ddNTP

ddNTPs vengono utilizzati per terminare la replica del DNA

i ddNTP non vengono utilizzati.
Gli enzimi coinvolti	vengono utilizzati DNA polimerasi.
Quattro enzimi sono usati: DNA polimerasi, sulfurilasi ATP, luciferasi e apyrasi.
Substrati usati	L'APS e Luciferin non vengono utilizzati.
Adenosina 5 'fosfosolfato (APS) e luciferina sono utilizzati.
Temperatura massima	Si tratta di un processo lento.
Questo è un processo veloce.
Sommario - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing	Sanger sequenziamento e Pyrosequencing sono due metodi di sequenziamento del DNA utilizzati nella biologia molecolare. Il sequenziamento di Sanger costruisce l'ordine dei nucleotidi in sequenza terminando l'allungamento della catena mentre il pirosequencing costruisce l'ordine preciso dei nucleotidi in sequenza per incorporazione di nucleotidi e rilevando il rilascio di pirofosfati. Pertanto, la principale differenza tra sequenziamento di Sanger e Pyrosequencing è che il sequenziamento di Sanger funziona sul sequenziamento per terminazione di catena mentre il pirosequencing funziona per sequenziare per sintesi.
Riferimento:
1. Fakruddin, Md e Abhijit Chowdhury. "Pyrosequencing-un'alternativa alla tradizionale sequenza di Sanger. "American Journal of Biochemistry and Biotechnology. Pubblicazioni sulla scienza, 02 marzo 2012. Web. 28 feb. 2017.	2. "Sequenza di Sanger. "Sequenza di Sanger - argomenti di ScienceDirect. N. p., n. d. Web. 28 feb. 2017

Immagine per gentile concessione:

1. "Didesoxy-Methode" di Christoph Goemans (modifiziert) - Il dottor Norman Mauder, auf Basis einer Datei von Christoph Goemans (CC BY-SA 3. 0) tramite Wikimedia Commons

2. "Sanger-DNA-seq" Da Enzo in lingua polacca Wikipedia (CC BY-SA 3. 0) tramite Wikimedia Commons

3. "Pyrosequencing" da microbiologie (CC BY-SA 2. 0) tramite Flickr